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    流式细胞仪应用及原理
    点击次数:503 发布时间:2017-08-07
     

    BD C6流式细胞仪

    流式细胞仪主要有两个基本的用途:*是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子,第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。


    1.  免疫细胞群的分类静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分,都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而,这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成,各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白(mIg),而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群,如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此,可由这些特征性的表面标志,将细胞分为不同的群或亚群。


    2.  免疫细胞的分化发育免疫细胞分化发育的不同阶段,其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞(发育过程中的T淋巴细胞),在发育的不同阶段从不成熟到成熟,其表面标志经历了从双阴性(CD4-CD8-)到双阳性(CD4-CD8-),直到单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)的过程。正常生理状态下,发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志,即可判定某些因素(基因突变等)对胸腺细胞发育的影响。


    3.  免疫细胞的分子表达免疫细胞的不同因素的影响下,其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化,可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如,静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子;而一经活化,其表达CD69分子数量明显增加。因此,可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。

    BD C6流式细胞仪
    4.  免疫细胞的分离如前所述,免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时,常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多,但用FACS来纯化特定的细胞群是目前为有效和方便的手段。例如,近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节(免疫抑制)功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时,首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合,再用FACS进行分离,就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐,也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。

    BD C6流式细胞仪(flowcytometer)是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置,由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物,因此,用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪(fluorescenceactivatedcellsorter,FACS),是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。

    其原理是在一组混合的细胞群中,加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体,这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合,结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面,称为荧光抗体标记的靶细胞;将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中,再通过FACS的进样吸管孔,仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。

    当每一个细胞通过仪器的激光束照射时,带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光,通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光(scatteredlight)可得到细胞大小及颗粒状态的信息;而从荧光的发射强度(fluorescenceemissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息,进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

    在流式细胞仪分离装置中,返回到计算机的信号,可用来产生一种电荷,这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔,在与吸管孔的液体流相相遇时,可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移,穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极,而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式,特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷,从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。

     
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