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    定量PCR仪的核心理念
    点击次数:766 发布时间:2016-08-12
     
       定量PCR仪是一种用来检测人体内相关DNA基因的一种仪器,此仪器虽属医疗器械,但我们在医院内通常接触不到他,因此我们对他的一些原理特性还不是很了解,下面了解一下定量PCR仪的核心理念吧。
      1.定量PCR仪的PCR技术的基本原理
      类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性;②模板DNA与引物的退火;③引物的延伸。DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
      2.定量PCR仪的PCR的反应动力学
      PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
      3.定量PCR仪的PCR扩增产物
      可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在*个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3'端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得定量PCR仪PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
     
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