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    定量PCR仪关于探针的解释
    点击次数:789 发布时间:2016-08-05
     
       虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量PCR仪技术,探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的,这主要是因为相对于荧光染料,探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,探针只要设计一条探针,因此探针设计较便宜方便,而且也能完成基本的定量PCR仪要求。当然定量方法由于还是要合成探针,也给实验操作带来了挑战。
      一般定量PCR仪实验过程为:目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验,优化条件→获得曲线数据,比对标准曲线→再重复验证。
      总体原则:
      先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
      所选序列应该高度特异,尽量选择具有小二级结构的扩增片段—这是因为二级结构会影响反应效率,而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测,如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度。
      为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)。
      将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
      探针位置尽可能地靠近上游引物。
      定量PCR仪检测探针的DNA折叠和二级结构。
      整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量—G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
      为确保引物探针的特异性,好将设计好的序列再核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
     
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