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    荧光定量PCR仪的扩增曲线和溶解曲线讲解
    点击次数:788 发布时间:2017-08-31
      在进行荧光定量PCR仪的实验时,不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为荧光定量PCR仪对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。
      有关荧光定量PCR仪的扩增曲线和溶解曲线:
      溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期,其形状是一条平滑的S型曲线。
      如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点,可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;
      如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头,可能原因是体系中模板量太高,建议模板稀释后再用。
      如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象,这在荧光定量PCR仪中很难避免;
      若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰,说明体系配置中存在污染,则实验结果不可用。
      在溶解曲线中出现双峰有三种可能:
      1.引物峰,引物峰通常是两峰中的前面一个,消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;
      2.在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在),出现原因是提取RNA时存在DNA污染,可以通过电泳验证,这时要重新消化RNA样品中的DNA;
      3.扩增非特异,这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
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