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    荧光定量PCR仪的实验心得、技巧分享
    点击次数:483 发布时间:2017-08-28
      荧光定量PCR仪试验中,质粒作为标准分子为何要线性化呢?
      因为要检测的目的基因如果不出意外的话,应该是线性的吧,而用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。单从变性和复性的难易上就会有很大的区别,当然会对引物的结合等各方面造成影响,且环状的空间构象和线性的空间构象上的差异。
      做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件,所以说,如果做标准曲线时可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话,就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般情况下是很难做到的。
      荧光定量PCR仪的荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验,当然是要求严格,当然如果检测的基因本身就是环状的,那当然不用线性化了。线性化比较麻烦:首先要酶切,保证完全酶切,才能全部线性化。
      然后要回收,质粒酶切后再回收容易被破坏,而且回收率也不是很高。线性化的质粒不容易保存,相对于环状质粒来说。所以,如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用,那就可以省去很多事情。
      荧光定量PCR仪的扩增曲线本底不断升高是什么原因?
      1、试剂质量差是主要原因;
      2、模板不纯是另一个重要原因;
      3、如果模板稀释后基线还有一定的上升,结果分析时可以避开初始的几个上升厉害的循环;建议选用质量可靠的试剂。
    北京科誉兴业科技发展有限公司(www.bntkq.tw)主营Micro17R/21R离心机,Eppendorf5424R离心机,Bio-Rad伯乐C1000,T100PCR仪,Leica DMi1倒置显微镜
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